罗布麻黄酮的提取及抗氧化活性的研究
摘要：本课题以罗布麻为原料，采用乙醇浸提法提取罗布麻中的黄酮，考察了乙醇溶剂浓度、提取时间、提取温度、料液比、提取次数等因素对罗布麻黄酮提取率的影响，其中选择了乙醇溶剂浓度、提取温度、提取时间、料液比四个因素设计正交实验来优化黄酮的最佳提取工艺，并对羟基自由基的清除和对超氧阴离子清除等两个方面进行黄酮抗氧化性的研究。得到的实验数据表明，影响罗布麻总黄酮提取的主要因素为乙醇溶剂浓度、液料比，其次提取时间、提取温度。罗布麻中黄酮的最佳提取工艺为乙醇溶剂浓度为65%，提取时间4h，温度80℃，料液比1:15，测得罗布麻总黄酮的含量为2.89%。除此之外，罗布麻黄酮对羟基自由基和超氧阴离子具有清除作用，且清除率与黄酮存在一定的量效关系。
关键词：罗布麻，黄酮，乙醇浸提法，抗氧化活性
Study Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Apocynum Venetum L.
13293432 YE Yixuan
（Department of Life Science, Qiu Zhen School of
Huzhou University, Huzhou 313000, ）
Abstract：The extraction of flavonoids in Apocynum venetum L. by ethanol extraction was studied in this paper. The effects of ethanol concentration, extraction time, extraction temperature, ratio of material to liquid and extraction times on the extraction rate of Apocynum venetum L. were investigated. The orthogonal design was used to optimize the extraction process of flavonoids, and the removal of hydroxyl radical and the removal of superoxide anion were studied. The flavonoids Study on Oxidation Resistance. The experimental data showed that the main factors affecting the extraction of total flavonoids of Apocynum venetum were ethanol solvent concentration, liquid to material ratio, extraction time and extraction temperature. The optimum extraction conditions were: ethanol concentration 65%, extraction time 4h, temperature 80 ℃, ratio of solid to liquid 1:15, total flavonoids content of Apocynum venetum was 2.89%. In addition, flavonoids of Apocynum venetum have a scavenging effect on hydroxyl radical and superoxide anion, and the clearance rate has a dose-effect relationship with flavonoids.
Key words: Apocynum venetum L, total flavonoids, extraction, optimization, antioxidant activity
目录
1引言1 1.1罗布麻的简介1 1.2罗布麻的研究前景1 1.3 罗布麻的价值1 1.4 罗布麻的化学成分1 1.5 黄酮类化合物简介1 1.6 罗布麻中黄酮类化合物的结构类型2 1.7 罗布麻中黄酮的提取方法2 1.8 罗布麻中黄酮的分析方法2 1.9本文研究内容2 2实验内容2 2.1 实验材料、试剂及仪器2 2.1.1 实验材料 2.1.2 实验试剂 2.1.3 实验仪器 2.1.4 实验附属仪器
2.2实验流程3 2.2.1 基本实验流程
2.2.2 紫外分光光度法实验流程 2.2.3 实验流程图
2.3 实验方法4 2.3.1 标准芦丁溶液的配制 2.3.2 标准曲线制备 2.3.3 计算公式推算 2.3.4 单因素考察 2.3.5 正交试验设计
2.3.6样品的制备 2.3.7抗氧化活性的研究 2.3.8计算方法
3结果与讨论8 3.1 单因素结果8 3.2 正交结果11 3.3 抗氧化活性研究结果12 3.4 讨论14 4.总结和展望14 4.1 实验总结14 4.2 展望14 参考文献15 致 谢16
1.引言
1.1 罗布麻的简介
罗布麻不仅可以称之为红麻，还可以叫做叫泽漆麻、野茶和吉吉麻或茶叶花。罗布麻（Apocynum venetum L.）实质上即为夹竹桃植物对应的叶或全草[1]。罗布麻主要集中在河南、西北、华北以及东北等不同区域。甘、微苦，凉，入肝经，清热平肝，利水消肿[2]。
罗布麻浑身是宝，秆可作为造纸原料，其对应的叶部位可以直接作为饲料与饮料的原料，而对应的根茎部位乳胶液则可以直接用于橡胶制作。就中医学的角度而言，其主要以地上部分作为入药材料，而罗布麻本身具备的药性微寒，味苦甘，功能为清热解火，息风平肝，主治头眩目晕、失眠等症状；叶的部分含有罗布麻苷，具有强心作用，可制成茶、药片、烟等形式，为治疗高血压的良药[3]。
1.2 罗布麻的研究前景
罗布麻是集药用、纺织业、食用与植被恢复及旅游观赏于一身的优良植物，是世界上稀少的优良的野生植物资源，罗布麻应用的综合开发对人类有着非常积极的意义。对罗布麻的开发利用开展实施阶段，可对其产业结构更好、更快的加以优化，获得更理想经济收益，还使综合开发、利用罗布麻有了更为可靠的根基，使其具备医用、绿化、食用、橡胶、饲草等诸多用途。罗布麻全身都有利用价值，皆能够作为药材食用，因为其各部分的生理活性存在差异，因此当前一般是通过现代中药提取分离技术来针对罗布麻药用价格展开研究，从而区分开各部分的各种有效成分，对症下药。未来将会对其有效成分更深入的展开分析。因此分离法、提取法、草渣使用、高新技术等在未来将会有非常大利用空间。 1.3 罗布麻的价值
罗布麻有着非常好的耐盐性能，因此在0.5%-1.0%含盐量的土壤中依旧能够生长，此外还能够在3米至4米的地下水位中生长，在盐层厚度为十厘米至二十厘米的地表荒地也能够生长。并且，其根系非常粗壮，且深，能够在强盐化的表土重盐层一米至两米之中，将地下含敖分少的水分吸取，能够成片地于敖土之中获得茁壮成长[5]。 1.4 罗布麻的化学成分
本实验采用的是罗布麻的叶，罗布麻叶中主要含含羟基的黄酮衍生物，单宁，酸类，脂肪酸醇，醇类，糖类，烷类有机物，氨基酸类，无机盐与其它化学成分等。 1.5 黄酮类化合物简介
黄酮类化合物大部分属于结晶体固体，但黄酮苷类比较特殊，属于无定形粉末。黄酮类化合物分子内有没有交叉共轭体系、取代位置、数目、助色团类别等诸多因素都能够对它的颜色发挥决定性的作用。
灰黄至黄色：黄酮、黄酮醇及其苷类； 黄至橙黄色：查耳酮； 不显色：二氢黄酮
显微黄色：异黄酮（二氢黄酮、异黄酮类）。
黄酮类化合物在经过羟基糖普化之后，能够更好地溶解于水中，但是相反而言，在有机溶剂内的溶解度却会越来越小。一般而言，在诸如甲醇、乙醇等的强极性溶液中，黄酮往往更容易溶解，
1
但是在诸如氯仿、笨等的有机溶剂之中，却难以溶解，甚至于完全不溶解。黄酮类化合物在水中的溶解度与其糖链呈正比，前者越大，意味着后者越长。 1.6 罗布麻中黄酮类化合物的结构类型
在罗布麻内最为根本的有效成分即为黄酮类化合物，而这里提出的该种化合物普遍是指有两个苯环，采用三碳链连接形成的系列化合物。根据三碳链对应的取代、成环以及氧化的特征，有可以将其中的黄酮类化合物分为黄酮、黄酮醇、双氢黄酮(醇)等各种不同种类。当前自然界中存在最多的产物主要是黄酮醇与黄酮。 1.7 罗布麻中黄酮的提取方法
目前，罗布麻总黄酮的提取方法包括：水提法、醇提取法、有机溶剂提取法、超声波提取法、溶剂回流提取法、微波提取法以及浸泡提取。本实验采用乙醇浸提法。称取适量的罗布麻粉，控制实验条件：加入适量浓度的乙醇溶剂，根据规定的乙醇料液比，严格把控温度，同时注意回流提取的时间以及次数，最后采用抽滤以及冷却等多种方式，得到最终需要的罗布麻黄酮提取液。 1.8 罗布麻中黄酮的分析方法
黄酮类化合物分析的方法很多。如今运用频率较高的方法有液相色谱一串联质谱法、气相色谱法一质谱联用法、旋光定量法、高效液相色谱法、分光光度法、薄层色谱法等，不同方法适用于不同的情况，需要从提取物的性质、工艺设备、提取费用消耗等诸多因素着眼来明确最佳的方案。本课题研究最终选用的方法是分光光度法，分光光度法在实验室应用中较为实用，有效，得出的结果可信度也相对较高。其中有铜离子络合法，系数倍率法，比色法，导数光谱法，多波长吸收度比值差法，旋光定量法等[6]。在不同的测量中采用最佳的方法以取得更优的结果。此次实验采用的是在紫外光分光光度法。 1.9 本文研究内容
罗布麻具有延缓衰老、降血压、降血脂、软化血管、解酒护肝、排毒养颜、安神助眠、解烟毒等功效，特别是罗布麻黄酮能使血小板内的环磷酸腺苷水平升高，并对血小板活化反应具有较强的抑制和抗血栓形成的作用。本文采用乙醇浸提法对罗布麻中的黄酮的提取进行研究。考察罗布麻黄酮提取的乙醇溶剂浓度、提取时间、提取温度、料液比、提取次数等单因素的影响。在此基础上通过正交设计优化了黄酮提取的工艺条件。同时还研究了罗布麻黄酮对•OH清除作用和对超氧阴离子清除活性的测定。
2. 实验内容
2.1 实验材料、试剂及仪器 2.1.1 实验材料
药店买的罗布麻。 2.1.2 实验试剂
主要化学药品和试剂见下表2-1。
表2-1 主要的化学药品和试剂
名称 芦丁标准品 NaNO2
纯度 分析纯
生产厂家
中国药品生物制品检定所
上海振欣试剂厂
2
Al(NO3)3 NaOH 乙醇 石油醚 蒸馏水
分析纯 分析纯 分析纯 分析纯
上海振欣试剂厂 湖州湖试化学试剂有限公司 湖州湖试化学试剂有限公司
杭州巨化公司 湖州师范学院生产
2.1.3 实验仪器
主要仪器与设备见下表2-2。
表2-2 主要仪器与设备
仪器名称 真空干燥箱 电热恒温水浴锅 循环水式真空泵 电子精密天平
离心泵
紫外-可见分光光度计
型号 ZK DK-98 SHZ-D(III) PB203N 0301149D UV-3100
厂家
北京科伟永鑫试验仪器厂 天津市泰斯特仪器有限公司 巩义市英峪予华仪器厂 梅特勒托利多仪器有限公司 常州国华电器有限公司 上海谱达仪器有限公司
2.1.4 实验附属仪器
烧杯，1mL移液管，2mL移液管，量筒，25mL容量瓶，50mL容量瓶，圆底烧瓶，冷凝管，布氏漏斗，抽滤瓶，玻璃棒，锥形瓶，称量纸，药匙，铁架台，洗耳球，抽滤纸。 2.2 实验流程 2.2.1 基本实验流程
罗布麻粉→加乙醇→水浴回流浸提→离心→抽滤→亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定→计算黄酮含量。
2.2.2 紫外分光光度法实验流程
罗布麻粉 → 加乙醇水浴回流浸提 → 抽滤 → 收集滤液 → lmL样液 →加入1.0mL的 5%亚硝酸钠→加入1.0mL的 10%的AL2(NO3)3→加入5mL 的4%NaOH→ 测量510nm吸光度 →计算黄酮含量。 2.2.3 实验流程图
具体流程图见图2-1。
罗布麻粉3g 加入乙醇，回流浸提后抽滤 药渣 取滤液1mL
亚硝酸钠-硝酸铝比色法
配液 分光光度法
3
测紫外吸收510nm 处吸光度
图2-1 提取罗布麻黄酮过程
2.3 实验方法
2.3.1 标准芦丁溶液的配制
根据相关文献记载，精密量取对照品溶液4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL，，将其置于依此编号1-5的5个25mL容量瓶中，加入1mL 的10％NaNO2溶液。5min后加入1mL的 10％AL(NO3)3溶液，摇匀6min后加入lmol／L的NaOH溶液5mL，用60％乙醇稀释定容，摇匀，制成含芦丁3.2～11.2μg／mL的系列标准溶液备用。 2.3.2 标准曲线制备
将5组制备好的标准芦丁溶液，按分光光度法，在510nm处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，做回归分析，得标准曲线 。测定结果见下表2-3与图2-2。
表2-3 芦丁的吸光度
芦丁浓度C(μg/mL)
吸光度(A)
33.716 0.043
42.133 0.105
50.550 0.160
58.967 0.197
67.384 0.256
0.3吸光度(A)0.20.10.020304050607080芦丁浓度C(μg/mL)图2-2 芦丁标准曲线
以对照品溶液浓C和吸光度A进行线性回归，得到回归方程为A=0.0127C+0.0098其中R2 = 0.9996，可知线性关系满足。线性的范围为8.46～67.38 μg / mL。 2.3.3 计算公式推算
Mn=C*V式中：
Mn：溶液中黄酮类化合物的总质量，g C：溶液中黄酮类化合物的浓度，(g/L) V：溶液中总体积，L； 黄酮提取率(％)=
Mn×100％式中： MMn：溶液中黄酮类化合物的总质量，g
4
M为原料的质量，g 2.3.4 单因素考察
(1) 乙醇溶剂浓度对黄酮提取率的影响
准确称取3g罗布麻叶粉，置于干燥的150mL圆底烧瓶中，分别加入35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液。控制溶剂料液比在1：15，提取时间为3h，提取温度为80℃，经过提取回流2次，提取清液之后，用移液管移取1mL滤液，然后在容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，静置5min后，加入1mL 的10％AL(NO3)3溶液，摇匀，再静置6min，加人5mL的 l mol／L的NaOH溶液，定容。在室温下放置30min，完全冷却后，在510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。确定最佳提取溶剂及浓度。
(2) 提取时间对黄酮提取率的影响
准确称取3g罗布麻粉，在经过干燥处理后的圆底烧瓶内（150ml）内放置，再将乙醇溶液（浓度为65%）加入其中，对料液比加以控制，为1:15，轻轻震荡使其混合均匀，然后在水浴锅内放置圆底烧瓶，对温度进行控制，为80℃，五个烧瓶的回流时间分别控制在1h，2h，3h，4h，5h。经过提取回流两次，提取获取提取液之后，用移液管移取1mL滤液，然后容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，静置5min后，加入10％AL(NO3)3溶液1mL，摇匀，6min后加人5mL的lmol／L的NaOH溶液，定容。在室温下放置30min冷却后，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。确定最佳提取时间。
(3) 提取温度对黄酮提取率的影响
称取罗布麻叶粉3g，在经过干燥处理后的圆底烧瓶（150ml）内放置，再将乙醇溶液（浓度控制在65%）加入其中，对料液比加以控制，为1:15，轻轻震荡使其混合均匀，，将圆底烧瓶置于水
60℃，70℃，80℃，90℃，100℃的温度展开试验，以每次3h的频率实施两次浴锅中，分别以50℃，回流操作，由此得到提取液，然后，用移液管移取1mL滤液，然后容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，5min，后加入10％AL(NO3)3溶液1mL，摇匀，6min后加人5mL的l mol／L的NaOH溶液，定容。在室温下放置30min冷却后，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。最终明确最佳提取温度。
(4) 料液比对黄酮提取率的影响
准确称取3g罗布麻粉，在经过干燥处理后的圆底烧瓶（150ml）内放置，再将乙醇溶液（浓度
1:10，1:15，1:20，1:25，轻轻震荡使其控制在65%）加入其中，对其料液比进行控制，分别为1::5，混合均匀，然后在水浴锅内放置圆底烧瓶，使温度控制在80℃，等待3h回流时间，并回流两次，取获取提取液之后，用移液管移取1mL滤液，然后容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，5min，后加入10％AL(NO3)3溶液1mL，摇匀，6min后加人5mL的lmol／L的NaOH溶液，定容。在室温下放置30min冷却后，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。最后对最佳的料液比加以明确。
(5) 提取次数对黄酮提取率的影响
准确称取3g的罗布麻粉，在经过干燥处理后的圆底烧瓶内（150ml）内放置，再将乙醇溶液（浓度为65%）加入其中，对料液比加以控制，为1:15，震荡摇匀，将圆底烧瓶置于水浴锅中，使温度控制在80℃，等待180min的回流时间，第一次回流完成后，滤渣重复操作三次，取获取提取液之后，用移液管移取1mL滤液，然后容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，5min，后加入10％AL(NO3)3溶液1mL，摇匀，6min后加人5mL的 l mol／L的NaOH溶液，在室温下放置30min冷
5
却后，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。确定最佳提取次数。
2.3.5 正交试验设计
取乙醇溶剂的浓度、提取温度及时间、料液比作为考察因素，每个因素选择三个水平进行实验，最终选择的参考指标是实验所成功提取的黄铜含量，下表2-4为详细的实验设计方案中各要素的取值。
表2-4 因素水平表
因素 水平 1 2 3
A 乙醇溶剂浓度
55% 65% 75%
B 温度(℃) 60 70 80
C 时间(h) 2 3 4
D 料液比 1：10 1：15 1：20
2.3.6 样品的制备
称量罗布麻粉一共3g，在经过干燥处理的圆底烧杯（150ml）内放置，再取乙醇（浓度为65%）45ml添至其中。对溶液的料液比加以控制，为1:15，提取时间、温度、回流提取次数分别为3h、80℃、2次，提取清液之后，通过移液管来移取滤液，滤液的容量为1ml,实施此操作之后，将浓度值10%的NaNO2溶液放入容量瓶内，取量1ml，保持静置，时间控制在5min，结束后把浓度10%的AL(NO3)3溶液添至内部，容量为1ML，轻轻摇晃，使其混合均匀，静置，保持6min，然后将l mol／L的NaOH溶液添至其中，容量为5ml，待其冷却，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。确定最佳提取溶剂及浓度。其余8个实验按正交实验设计表2-5依次进行。
表2-5 正交实验安排
实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A乙醇溶剂 1（55%） 1（55%） 1（55%） 2（65%） 2（65%） 2（65%） 3（75%） 3（75%） 3（75%）
B温度（℃）
1(60) 2(70) 3(80) 1(60) 2(70) 3(80) 1(60) 2(70) 3(80)
因素
C时间（h）
1(2) 2(3) 3(4) 2(3) 3(4) 1(2) 3(4) 1(2) 2(3)
D料液比 1(1:10) 2(1:15) 3(1:20) 3(1:20) 1(1:10) 2(1:15) 2(1:15) 3(1:20) 1(1:10)
2.3.7 抗氧化活性的研究
精确称取罗布麻粉3g，200mL石油醚提取40min，去除石油醚，再把去脂后的罗布麻粉放置到30mL蒸馏水中，浸泡时间为24h，随后通过减压浓缩，实施热过滤，得到浓缩状态下的罗布麻总黄酮液体，然后稀释至料液比大致为1:15。样品的测定: 准确吸取1.0mL的罗布麻的黄酮提取液于烧杯中，并加入1mL蒸馏水、4mL 4% NaOH溶液，并将其作为对照组进行吸光度值的测定。结合回归方程对样品中黄酮总含量实施计算。
(1) 罗布麻黄酮对·OH的清除作用
对Fenton反应法进行参考，从而将·OH自由基产生体系模型构建起来[7]。在混合H2O2、Fe2+两
6
种溶剂之后，能够形成·OH，其Fenton反应式子是：
OH的反应活性非常强，加之反应快H2O2 +Fe2→OH-.OHFe3+，由于·
速，因此于536nm处，产物的吸收非常强烈，此时若将能够对·OH进行有效清除的被测物添至其中，那么能够和邻二氮菲产生竞争，从而结合·OH。然后通过固定反应时间法，对于反应液体的吸光度，在536nm处进行测量，与空白液进行对比，那么就可以很好地测量·OH受到的被测物的清除作用效果。
分别将浓度为0.75mmol·L-1的邻二氮菲溶液、PH=7.4的PBS缓冲液放入五个烧杯内，取量分别为1ml、3.5ml,对其进行摇晃，使混合均匀，结束后将浓度为0.75mmol·L-1的FeSO4溶液加入其中，选量为1.5ml，，及时使溶液混合均匀。再将不同量的黄酮溶液分别添至五个烧杯之中，混合均匀后，放在温度为37℃的水中进行反应，60min后对吸光度A536(加药)进行测量，在536nm波长中开展。与上述方法相同，提取液用H2O2替换，据此来对A536(损伤)加以测定。与上述方法相同，H2O2、提取物都不增加，对A536（未损伤）加以测定。
计算·OH清除率。 ·OH清除率= A2-A1/ A0- A1
上面的式子中: A0对应H2O2溶液未添加时的吸光度； A1：对应H2O2溶液添加之后的吸光度； A2：加黄酮溶液时的吸光度。 (2) 黄酮对O2的清除作用
此过程运用了邻苯三酚自氧化法[14]。在碱性环境下（pH=8.2）邻苯三酚会出现自氧化，通过此反应O2-·、有色中间产物得以产生，其中有色中间产物的相对吸收峰存在于420nm之中。将O2-· 清除剂添至反应中这一过程，使得O2-· 的生成遭受抑制，邻苯三酚据而出现自氧化逆反应，在420nm处，溶液的吸收峰会越来越小，因此只需要对A420相对值进行测量就能够对自氧化反应的程度作出判断，且能够将O2-清除剂的清除率计量出来。
选取 tris-HCl缓冲溶液（浓度0. 05mol·L-1）及蒸馏水各5ml，分别添至五个经过干燥处理的烧杯内，pH=8.2,轻轻摇晃使其均匀混合，于水浴锅（25℃）内放置烧杯，进行加热，持续
1mL、1.5mL、2mL、2.5mL的黄酮溶20min，再将烧杯取出。在五个烧杯中，分别将浓度为0.5mL、液添至其中，然后取0.3ml的邻苯三酚（3mmol·L-1）分别添至烧杯内，再次放入25℃的水浴锅中加热30s，加热期间补加蒸馏水至25mL。再放置于温度为25℃的水中反应4min，最后再将HCl（浓度8mol·L-1）滴入两滴，据此来迫使终止反应过程。吸光度的测定选择在420nm处进行，样品选取的参比物是浓度相同的试样提取物，模型组则使用蒸馏水对试液进行代替。
通过下面的式子对清除率进行计算。
清除率= (A空白-A样品) / A空白×100%
式中：A空白=溶液的吸光度
A样品=黄酮溶液的吸光度
2.3.8 计算方法
(1) 测定吸光度方法
得出粗提液在510nm处有最高峰，据文献记述，黄酮在510nm处有吸光度，得出此粗提液中含有黄酮类化合物。以下为正交试验后按照最佳的实验条件所进行的操作过程及计算方法。
7
(2) 测定黄酮对抗氧化的作用 测定•OH受黄酮的清除作用：
清除率d(%)=（A加药–A损伤）/ (A未损伤–A损伤)
（A空白–A样品）/ A空白 测定超氧阴离子受黄酮的清除活性：清除率d(%)=
3. 结果与讨论
3.1 单因素结果
(1) 乙醇溶剂浓度对黄酮提取率的影响
乙醇溶剂浓度对黄酮提取率的影响结果见表3-1和图3-1。
表3-1 乙醇溶剂浓度对黄酮提取率的影响
乙醇溶剂浓度（%） 黄酮总提取率（%）
25 1.90
35 2.10
45 2.20
55 2.70
65 2.75
75 2.60
85 2.10
95 1.05
黄酮总提取率（%）2.41.60.8306090
乙醇溶剂浓度（%）图3-1 乙醇溶剂浓度对黄酮提取率的影响
结果可见，在溶剂浓度为25%-65%时，黄酮总提取率随溶剂浓度增加而提高。在溶剂浓度大于65%时，黄酮总提取率随溶剂浓度增加而降低。故我们确定其中溶剂浓度为65%的时候黄酮得率最高，提取到2.75%的黄酮。
(2) 提取时间对总黄酮提取率的影响
提取时间对总黄酮提取率的影响结果见表3-2和图3-2。
表3-2 提取时间对总黄酮提取率的影响
提取时间（h） 黄酮总提取率（%）
1 1.73 2 2.42 3 2.53 4 2.50 5 2.43 8
黄酮总提取率（%）2.42.11.80246
提取时间（h）图3-2 提取时间对总黄酮提取率的影响
最终结果显示：若提取时间介于1h-3h，当时间越来越久多，黄酮的总提取率会越来越高；当提取时间介于3h至5h之间，黄酮总提取率随时间增加减少，原因在于反应期间，乙醇会发生挥发作用，因此导致加热时间持续过长，或者是反应液沸点越来越高，从而导致黄酮类化合物结构破坏，因此在3h-5h之间提取率随时间的增加减少。所以得以乙醇浸提法提取罗布麻叶黄酮类化合物，当提取时间控制在3h时，提取效果较为理想，能提取到2.53%的黄酮。
(3) 提取温度对总黄酮提取率的影响
总黄酮提取率受提取温度的影响情况可通过下表3-3、图3-3进行体现。
表3-3 总黄酮提取率受提取温度的影响
提取温度(℃) 黄酮提取率(%)
50 2.01
60 2.45
70 2.51
80 2.52
90 2.44
100 1.93
2.6黄酮总提取率（%）2.42.22.04060提取温度(℃)
图3-3 提取温度对黄酮提取率的影响
801009
结果显示：当温度小于80，伴随温度的不断增加，黄酮提取率会越来越高。尤其在50℃＜T＜60℃时，黄酮提取率急剧上升，在60℃＜T＜80℃黄酮提取率上升缓慢；当T＞80℃时，黄酮总提取率随温度的增加而降低，在80℃＜T＜90℃时，随着温度上升，黄酮提取率在缓慢下降，当T＞90℃时，随着温度上升，黄酮的提取率在急剧下降。故猜想:可能是因为温度超过一定界线，导致某些黄酮类化合物挥发或结构被破坏的缘故，所以得以乙醇浸提法提取罗布麻叶黄酮类化合物，提取温度控制在80℃，能够给获得最佳的提取成效，能提取到2.52%的黄酮。
(4) 料液比对黄酮提取率的影响
不同料液比下总黄酮提取率所受的影响程度具体可见下表3-4及下图3-4.
表3-4 料液比对黄酮总提取率的影响
料液比 黄酮总提取率（%）
1：5 2.02
1：10 2.66
1：15 2.80
1：20 2.81
1：25 2.80
2.8黄酮总提取率（%）2.42.01:51:101:151:201:25
料液比图3-4 料液比对黄酮总提取率的影响
通过试验结果可知，若溶剂的料液比介于1:5-1:15之间，伴随料液比的上增，黄酮提取率亦会上增。如果料液比＞1:15，那么伴随其增加，黄酮提取率不会随之出现较大的变化。由此可知当料液比介于1:15之间，溶剂的用量能够将黄酮类物质基本提取出。所以我们可以得出，考虑工业实际，当料液比为1:15时，提取效果较为理想，能提取到2.80%的黄酮。
(5) 提取次数对黄酮总提取率的影响
对提取液黄酮在各种提取次数条件下的提取率进行测定，下表3-5及图3-5为最终的结果。
表3-5 提取次数对黄酮总提取率的影响
提取次数 黄酮总提取率（%）
1 1.91
2 2.58
3 2.58
4 2.59
10
2.7黄酮总提取率（%）2.42.11.81234
提取次数图3-5 提取次数对黄酮总提取率的影响
结果显示：通过1-2次的提取之后，随着次数的增加，黄酮总提取率会随着而增加。但若次数在2次以上，增加变化将会越来越微弱。所以考虑工业程序，可得经过2次提取后罗布麻叶黄酮基本全部溶出。因此最终判定，最佳的工艺条件是提取次数为2次。 3.2 正交结果
表3-6为罗布麻总黄酮提取正交试验结果。
表3-6 正交实验结果
实验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
K1 K2 K3 k1 k2 k3
A乙醇溶剂
1（55%） 1（55%） 1（55%） 2（65%） 2（65%） 2（65%） 3（75%） 3（75%） 3（75%） 6.7568 7.0027 6.6829 2.2522 2.3342 2.2276 0.1066
因素
B温度（℃）
1(60) 2(70) 3(80) 1(60) 2(70) 3(80) 1(60) 2(70) 3(80) 6.7331 6.8021 6.9072 2.2443 2.2673 2.3024 0.0581
C时间（h）
1(2) 2(3) 3(4) 2(3) 3(4) 1(2) 3(4) 1(2) 2(3) 6.7295 6.7877 6.9252 2.2431 2.2625 2.3084 0.0653
D料液比 1(1:10) 2(1:15) 3(1:20) 3(1:20) 1(1:10) 2(1:15) 2(1:15) 3(1:20) 1(1:10) 6.6685 6.9502 6.8237 2.2228 2.3167 2.2745 0.0939
实验指标 黄酮（%） 2.1485 2.2848 2.3235 2.3016 2.3187 2.3824 2.2830 2.1986 2.2013
水平和水平均值 极差 R
11
水平试验结果总和=K1、K2、K3
水平试验结果总和的平均值=k1、k2、k3
R属于极差，对相同因素中，各种水平状态下，试验结果的变化幅度加以反映。R的数值越大，意味着试验结果会受到这一因素越大的影响，重要性愈加显著。结果可见：RA＞RD＞RC＞RD ，所以提取溶剂浓度＞料液比＞提取时间＞提取温度。
经K值分析结果表明：A2B3C3D2的组合，黄酮提取率最高。因此罗布麻的最佳提取条件为：提取溶剂为65%乙醇，提取温度80℃，提取时间为4h，料液比1: 15。 3.3 最佳工艺验证
准确称取3g罗布麻叶粉，置于干燥的150mL圆底烧瓶中，加入65%的乙醇溶液。控制溶剂料液比在1：15，提取时间为4h，提取温度为80℃，经过提取回流2次，提取清液之后，用移液管移取1mL滤液，然后在容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，静置5min后，加入1mL 的10％AL(NO3)3溶液，摇匀，再静置6min，加人5mL的 l mol／L的NaOH溶液，定容。在室温下放置30min，完全冷却后，在510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。确定最佳提取溶剂及浓度。此实验重复操作3次。结果见表3-7，提取率达到2.89%。
表3-7黄酮提取率的测定
实验次数 平行一 平行二 平行三
黄酮总提取率（%）
2.89 2.85 2.94
平均值（%）
2.89
3.4 抗氧化活性研究结果
(1) 黄酮对-OH清除作用的测定
下表3-8及图3-8为•OH所受黄酮的清除作用的测量结果。
表3-8 提取物在不同体积下的抑制率
体积(mL) A536 (加药) A536 (损伤) A536 (未损伤) 清除率(%)
6.931
33.634
0.4 0.127
0.8 0.208
1.2 0.217 0.106 0.409 36.634
64.686
77.888
1.6 0.302
2.0 0.342
12
807060清除率(%)504030201000.00.40.81.21.62.02.4体积(mL)图3-8 黄酮对•OH的清除作用
由结果可见，罗布麻黄酮对-OH有不同程度的清除作用。用量在0.4mL-2.0mL内，罗布麻黄酮对-OH清除率会随着提取物体积的增加而升高。当用量在0.8 mL -1.2 mL时，罗布麻黄酮对•OH的清除率变化不大，当用量大于1.2 mL时，清除率上升迅速。
(2) 黄酮对超氧阴离子清除活性的测定
黄酮对超氧阴离子清除活性测定结果见表3-9和图3-9。
表3-9 提取物在不同体积下的清除率
体积(mL)
Ai Ao 清除率(%)
3.271
4.206
0.5 0.207 1.0 0.205 1.5 0.197 0.214 7.944
11.215
20.093
2.0 0.190 2.5 0.171 13
302520清除率(%)1510500.00.51.01.52.02.53.0
体积(mL)图3-9 黄酮对超氧阴离子的清除作用
由结果可见，不同体积的黄酮对超氧阴离子有不同的清除作用。在2.0mL浓度范围内，随着提取物体积的增加对超氧阴离子清除率提高。当用量超过2.0mL时，罗布麻黄酮对超氧阴离子的清除率上升趋势比较明显。 3.4 讨论
通过正交实验得出A2B3C3D2的组合为最佳条件：提取溶剂为65%乙醇，提取温度、时间急料液比分别为80℃、4h、1: 15，黄酮提取率达到2.89%。其中提取溶剂浓度对黄酮的提取结果影响最为明显，料液比、提取时间、提取温度次之。因此影响罗布麻中提取黄酮的含量的单因素的主次排序为：A（提取溶剂浓度）＞D（料液比）＞C（提取时间）＞B（提取温度）。通过对罗布麻黄酮的抗氧化性的研究结论得出，黄酮对羟基自由基和超氧阴离子有一定的清除率，清除率与黄酮的用量存在着一定的量效关系。当浓度已经限定，由于提取物用量的上增，清除率亦会随之上增。当用量为0.8mL-1.2mL时，罗布麻黄酮对•OH的清除率趋于平缓。但是当用量超过1.2mL时，罗布麻黄酮对•OH的清除率上升趋势比较明显；在2.0mL浓度范围内，随着罗布麻黄酮体积的增加对超氧阴离子清除率提高。当罗布麻黄酮用量超过2.0mL时，罗布麻黄酮对超氧阴离子的清除率上升趋势更加明显。
4. 总结和展望
4.1 实验总结
本文采用乙醇浸提法研究罗布麻黄酮提取的溶剂的浓度、液料比、提取的时间及提取的温度、提取的次数等单因素对黄酮提取的影响，并通过正交优化实验优化乙醇浸提法提取罗布麻中的黄酮工艺。通过对乙醇溶液浓度研究，试验结果表明当乙醇溶液的浓度为65%时，能够获得最佳提取效果；在展开提取时间分析试验后，结果表明当提取时间为3h时，能获得最佳提取效果；通过对提取温度的研究，得出80℃为最佳的提取温度；通过对料液比的研究，得出最佳的料液比为1:15。将这四个单因素进行正交实验得出最佳实验条件为：提取溶剂65%乙醇，提取的温度、时间及料液
14
比分别为80℃、4h、1: 15，同时得出的结论有提取溶剂浓度对罗布麻中黄酮的提取结果影响最为明显，料液比、提取时间、提取温度为次之因素。经过罗布麻黄酮的抗氧化性的研究，得出黄酮对•OH与超氧阴离子有一定的清除作用，且清除作用与黄酮的体积存在一定的量效关系。 4.2 展望
由于人民生活水平的不断提高以及现代生态环境保护理念的普及，人们对罗布麻的应用开发重视程度增加。那些无法开展耕地的盐渍地，例如沿海滩涂、沙荒地等，对罗布麻进行引种，除了能对废弃地加以利用，据此来生产纤维、药材、造纸原料等，生态环境可借此得以优化，为社会创造更多的就业岗位，据此来更好地调整当地的产业结构，还将最大化地拓展农业发展，最大化效益。依托于深入、系统地针对罗布麻的诸多化合物展开分析，能使研究更加深入，此外罗布麻药用的研究也因此有了更坚实的根基，就通过对罗布麻次生代谢产物的利用对药物的开发也因此有了新的途径。本实验只是做了中药中罗布麻总黄酮用乙醇浸提提取的影响因素，正交反应的最佳条件及黄酮的抗氧化活性的研究，仍需针对中药提取物的药效学、分离鉴定等展开更深入的分析。着眼于长期发展，黄酮提取的分析研究具有一定的意义和发展前景。
参考文献
[1]吴贻谷, 丁绪亮, 刘天培, 宋立人. 中国医学百科全书[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1991, 37(28): 13547-13549
[2]李经纬, 余瀛鳌, 欧永欣. 中医大辞典[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1995(5): 23-26 [3]林众, 刘斌, 丁勇. 华旅游通典[M]. 北京: 社会科学文献出版社, 2004(10): 231-235 [4]喻春明. 罗布麻的概况及开发利用前景[J]. 中国麻作, 1996, 18(3): 40-41
[5]周笃, 褚金鳌. 柴达木盆地罗布麻植物资源与开发利用[J]. 青海科技, 1998, 5(2): 47-48
[6]苏玉顺, 李艳君, 赵方振. 紫外一可见分光光度法在植物多糖含量测定中的应用[J]. 光谱实室, 2011, 28(3): 1101-1108
[7]金鸣, 蔡亚欣, 李金荣. 邻二氮菲- Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基的新方法[J]. 生物化学与生物物理进展, 1996, 23(6): 553-555
[8]李彩侠, 张斌彬, 吴亚卿. 荷叶中黄酮类化合物的提取工艺研究[J]. 上海理工大学学报, 2006, (28): 5-8
[9]土桃云, 土金虎, 吴伟军. 鸡爪械黄酮提取工艺研究[J]. 江苏中医药, 2006, (27): 50-52
[10]玛丽华, 江丰, 袁匕峰. 金钱草总黄酮的超声提取工艺研究[J]. 江西医学院学报, 2005, (45): 60-63
[11]刘玉红, 徐凌川. 金盏银盘总黄酮的含量测定[J]. 食品与药品, 2006, (8): 49-50
[12]杜鹃, 张晓敏, 徐金玉. 玫瑰花中黄酮类色素的提取工艺研究[J]. 冷饮与速冻食品工业, 2006, (12): 23-26
[13]陈海芳, 周文明, 傅建熙. 沙棘叶总黄酮提取工艺研究[J]. 西北农业学报, 2006, 15(1): 148-152 [14]李瑶, 齐晓丽, 孟祥颖. 竹叶中黄酮提取纯化工艺研究[J]. 东北师大学报(白然科学版), 2006, 38(1): 91-94
[15]游新侠, 仇农学. 超声波辅助提取荆芥叶中总黄酮的方法研究[J]. 郑州牧业工程高等专科学校学报, 2006, 2(26): 26-30
[16]左锦静, 陈复生, 姚永志. 陈皮中黄酮类化合物的最佳提取工艺.食品研究与开发[J]. 2005, 6(26):
15
61-63
[17]李艳丽, 黄强, 班春兰. 从银杏叶中提取银杏黄酮的研究[J]. 精细与专用化学品, 2006, 2(14): 20-22
[18]许牡丹, 杨伟东. 大豆胚芽中异黄酮和皂试的提取工艺[J]. 粮油食品科技. 2006(2): 25-26 [19]翁贵英, 李金辉. 不同溶剂法对西南委陵菜根、叶的总黄酮含量测定[J]. 六盘水师范高等专科学校学报. 2005(17): 16-19
[20]朱宇旌, 张勇, 王纯刚. 红三叶黄酮抗氧化性研究[J]. 食品科技, 2006, 78(4): 78-81
[21]郎娜, 罗红霞. 黄花菜中黄酮类物质抗氧化性的研究[J]. 食品研究与开发, 2007, 128(3): 74-77
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致 谢
本文是在导师郭玉华的悉心指导下完成的。刚开始做实验时没什么头绪也遇到很多困难，郭老师总会在旁边耐心细心地给予指导，帮助我完成实验和论文修改，在此我向老师表示最诚挚的感谢。感谢导师的辛勤培养和严格要求。在此，谨向导师致以最崇高的敬意、最衷心的感谢。在论文完成过程中，一起做实验的王妍同学给予了我大量的帮助和建议，他们对我的热情帮助和支持，使我获益良多，在此表示衷心的感谢！
同时，感谢被本文引用的文献的作者，以及所有给予我关心和帮助的老师及同学。
姓名：叶亦璇
2016年11月于湖州师范学院求真学院
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