血小板活化因子参与血小板2中性粒细胞活化的研究

　　文章编号(ArticleID):1009-2137(2005)03-0447-05

・论著・血小板活化因子参与血小板2中性粒细胞活化的研究

郭农建,常亚丽,肖东杰,黄平

山东大学临床医学院,济南市中心医院,济南250013

摘要　　本研究的目的是探讨全血中血小板活化因子(platelet2activatingfactor,PAF)参与血小板2中性粒细胞相互

作用的病理2生理机制,为PAF受体拮抗剂的临床应用提供理论依据。将PAF受体拮抗剂银杏内酯B(ginkgolidesB,GBBN52021)加入全血中,以阻断PAF对血小板2中性粒细胞的活化作用;将已知的PAF及二磷酸腺苷(ADP)分别加入全血中,用流式细胞术(FCM)检测血小板CD62P的表达;将已知的PAF及ADP分别加入全血中,用FCM检测中性粒细胞细胞CD11b的表达;将PAF及ADP分别加入全血中,用FCM检测血小板2白细胞聚集物(PLA),即PLA/L包括百分率及CD42b中位荧光浓度(MFI)。结果表明:PAF及ADP均增加CD62P、CD11b、PLA的表达;PAF受体拮抗剂(银杏内酯B)明显抑制PAF诱导的CD62P、CD11b的表达及PLA的形成,但不能完全抑制血小板、中性粒细胞的活化及血小板2白细胞之间的相互作用;银杏内酯B也抑制ADP诱导的CD62P、CD11b的表达,但不能完全抑制血小板、中性粒细胞活化;银杏内酯B对ADP诱导的血小板2白细胞的聚集无明显抑制作用。结论:血小板2中性粒细胞的相互作用机制复杂,有多种细胞因子、化学介质参与其中,有多种配基2受体介导血小板2中性粒细胞的交互作用。PAF受体拮抗剂—银杏内酯B有明显拮抗PAF的作用,在防治血栓形成与炎症过程中可能具有广泛的应用前景。关键词　　血小板活化因子;血小板;中性粒细胞;银杏内酯B中图分类号　　R3311143;R364115文献标识码　　A

ActivationofPlatelet2NeutrophilMediatedbyPlatelet2ActivatingFactor

GUONong2Jian,CHANGYa2Li,XIAODong2Jie,HUANGPing

DepartmentofHematology,Ji’nanCentralHospital,ClinicalMedicalCollege,ShandongUniversity,Ji’nan250013,China

Abstract　　Toinvestigatethepathophysiologicalmechanismsforplatelet2neutrophilscrosstalkmediatedbyplatelet2activatingfactor(PAF)andtolayafoundationforclinicalapplication,ginkgolidesB(GB),aPAFreceptorantagonist,wasaddedinthewholebloodtoblocktheeffectsofPAFonactivationofplatelet2neutrophil;PAFandADPwererespectivelyaddedinthewholebloodtomonitortheexpressionofCD62Ponplateletbyflowcytometry;PAFandADPwereaddedinthewholebloodtomonitortheexpressionofCD11bonneutrophilbyflowcytometry;PAFandADPwereaddedinthewholebloodtomonitortheplatelet2leucocyteaggregates(PLA)whichwerePLAinthetotalleucocytepopulation(PLA/L)andthemeanfluorescenceintensity(MFI)ofCD42b.Outcomeswereanalyzedbyt2test,andthedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.05).TheresultsshowedthattheexpressionofCD62Ponplatelats,theexpressionofCD11bonneutrophilsandPLAformationwereallincreasedbyPAFandADP;thePAFreceptorantagonists(GB)couldobviouslyinhibittheexpressionofCD62P,CD11bandPLAformationinducedbyPAF,butcouldnotcompletelyinhibittheactivationofplateletandneutrophil,andtheplatelet2neutrophilcrosstalk;GBcouldinhibittheexpressionofCD62PandCD11binducedbyADP,butcouldnotconpletelyinhibittheactivationofplateletandneutrophli;GBcouldnotobviouslyinhibittheplatelet2leucocyteaggregatesmediatedbyADP.Itisconcludedthatthemultiligand2receptorsystemsinvolvedinPLAformationandplatelet2netrophilscrosstalkseemtoberegulatedbycomplexmechanisms;thePAFreceptorantagonists(GB)obviouslyinhibittheeffectofPAF,andmaybewidelyutilizedinthetherapyofthrombosisandinflammation.Keywords　　PAF;platelet;neutrophil;ginkgolidesB

JExpHematol2005;13(3):447-451

研究证实,血栓形成的病理机制涉及多种因素,主要包括血管与血细胞的相互作用及血液中不同细胞的相互作用。证据表明:血小板活化后可以结合白细[1][2,3]胞,并使其活化;相反,白细胞活化后分泌的

某些细胞因子,也可活化血小板

[4,5]

。因此,血小板2

通讯作者:郭农建,主任、主任医师.电话:(0531)6983044.E2mail:

gujian2002@yahoo.com.cn

2004-07-07收稿;2005-02-07接受

・448・白细胞的相互作用,尤其是血小板2中性粒细胞的相互作用,在血栓形成及炎症过程中起着重要作用[6,7]。血小板活化因子(platelet2activatingfactor,PAF)是近年来发现的一种内源性脂类介质,在血栓形成、急性炎症、哮喘、过敏反应、休克、风湿病、移植

排斥、凋亡等病理生理过程中起重要作用[8]

。PAF作为迄今发现的最强的血小板聚集诱导剂和炎症因子[9]

,参与血小板2中性粒细胞的活化,并在多种病理生理过程中起重要作用。

研究发现,在中性粒细胞、单核细胞、血小板、内皮细胞等表面均具有特异性PAF受体,许多PAF受体拮抗剂,如银杏内酯B(ginkgolidesB,GBBN52021)、WEB2086、Lexipafant等可以拮抗这些受体,从而抑制PAF对血小板2中性粒细胞的活化,其中一些受体可在人类安全应用。本研究目的是通过分子生物学手段、全血流式细胞术方法,进一步了解PAF如何激活血小板2中性细胞及其相互作用的病理2生理过程,特别在血栓形成及炎症过程的作用,为PAF受体拮抗剂的研究开发、临床应用提供理论依据。

材料和方法

研究对象

30名健康人,均为本院的健康职工和本院健康查体中心的查体人员,其中男性8人,女性22人,年龄在22-50岁之间,中位数38岁。对所有研究对象均从肘前静脉取血。在静脉穿刺前2周之内,研究对象均否认服用过阿司匹林及其他抑制血小板活化的药物。

主要试剂

刺激剂和拮抗剂:血小板活化因子(PAF)、二磷酸腺苷(ADP)、PAF受体拮抗剂(GB)均购自美国Sigma公司。血小板活化识别标志Mouse2IgG2PE、CD612PerCP、CD62P2PE,中性粒细胞活化识别标志Mouse2IgG2PE与CD11b2PE及PLA/L识别标志CD452PerCP、CD42b2FITC、Mouse2IgG2FITC均购自美国BectonDickinson公司。

主要仪器

FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson公司产品)、混匀震荡器(上海彭氏实业有限公司产品)、离心机(白洋离心机厂产品)、加样器(ThermoLab2systems)及相应的吸头、12mm×75mmFalcon管(BectonDickinson公司产品)。

中国实验血液学杂志　JExpHematol2005;13(3)

血液采集和标本准备

血液采集均用静脉穿刺术收集没有淤血的肘静脉血,注入含有1/10容量的3.8%枸橼酸钠真空塑料试管轻轻混匀,准备好的样品用于血小板、白细胞活化及血小板2白细胞聚集分析。实验方法刺激　①在3-5分钟内收集全血;②将抗凝血分别加入2个塑料试管,随后加入PAF受体拮抗剂(终

浓度GB10-4

mmol/L),为2、4管,室温下作用10分钟;剩余2个试管只加入抗凝血,为1、3管;③向

1、2管加入PAF(终浓度5×10-5

mmol/L),向第3、

4管加入ADP(终浓度2×10-4

mmol/L),室温作用20分钟。

血小板活化测定　分别取Mouse2IgG2PE、CD612Per2CP各20μl、枸橼酸钠抗凝血5μl,PBS缓冲液50μl加入塑料试管中混匀作为血小板活化标志的对照管,另取CD262PE、CD612PerCP各20μl、枸橼酸钠抗凝血5μl、加入刺激剂和拮抗剂的第1、2、3、4管抗凝血各5μl、PBS缓冲液50μl分别加入5个塑料试管中混匀作为血小板活化的标志测定管,室温条件下避光作用20分钟,立即加入预冷2-8℃1%的PFA0.5ml混匀,置2-8℃冰箱内,6小时内在流式细胞仪上进行测定。血小板2白细胞活化测定　分别取Mouse2IgG2FITC、CD452PerCP各20μl、枸橼酸钠抗凝血5μl,PBS缓冲液50μl加入塑料试管中混匀作为PLA的对照管;另取CD42b2FITC、CD452PerCP各20μl、枸橼酸钠抗凝血5μl、加入刺激剂和拮抗剂的第1、2、3、4管的抗凝血各5μl、PBS缓冲液50μl分别加入5个塑料试管中混匀作为PLA/L测定管,室温条件下避光作用20分钟,立即加入预冷2-8℃1%的PAF0.5ml混匀,置2-8℃冰箱内,6小时内在流式细胞仪上进行测定。粒细胞活化测定　分别取Mouse2IgG2PE20μl、枸橼酸钠抗凝血100μl加入塑料试管中混匀作为中性粒细胞活化标志的对照管;另取CD11b2PE20μl和枸橼酸钠抗凝血100μl、加入刺激剂和拮抗剂的第1、2、3、4管抗凝血各100μl,分别加入5个塑料试管中混匀作为CD11b测定管,室温条件下避光作用20分钟,然后加入200μl溶血素和2ml蒸馏水,室温条件下作用10分钟,低速离心机(380×g)离心5分钟,去上清液,用PBS2ml洗涤,再次离心5分钟,去上清液,立即加入预冷2-8℃1%的PAF0.5ml混匀,置2-8℃冰箱内,6小时内在流式细胞仪

血小板活化因子参与血小板2中性粒细胞活化的研究・449・

上进行测定。

流式细胞仪检测和数据分析

样品用FACSCalibur流式细胞仪检测分析,激发光为氩离子激光488nm谱线,使用CaliBRITE标准微球校准流式细胞仪,FACSComp软件调节流式细胞仪PMT电压、荧光补偿、灵敏度等,使用CellQuest软件获取数据,用荧光或FSC设阈值,收集20000个细胞,使用CellQuest软件分析数据,圈定目的细胞群体,以双色点图显示各细胞百分率。①以CD612PerCP/SSC双参数设门,分析对照管、测定管(PAF组、PAF+GB组、ADP组、ADP+GB组)CD62P阳性百分率。②CD452PerCP/FSC双参数设门,测定对照管和测定管(PAF组、PAF+GB组、ADP组、ADP+GB组)PLA/L,包括百分率及CD42b2FITC中位荧光强度(MFI)。③FSC/SSC双参数圈定粒细胞群,分析对照管、测定管(PAF组、PAF+GB组、ADP组、ADP+GB组)CD11b的MFI。统计分析

计量资料用均数±标准差(X󰁦±SD)表示,数据分析采用t检验,P<0.05有统计学意义。统计分析采用PEMS.Version2.0统计软件包。

显高于对照组;ADP+GB组的CD62P表达率

[(52167±8.93)%]亦高于对照组;ADP组CD62P表达率高于ADP+GB组(P<0.01,n=30)(附表、图1)。

PAF组CD62P表达率[(76.08±7.36)%]明显高于对照组;ADP组的CD62P表达率[(64.74±9.92)%]亦高于对照组;PAF组CD62P表达率明显高于ADP组(P<0.01,n=30)(附表、图1)。CD11b表达

PAF组CD11b的中位荧光浓度(MFI)(522.65±102.18)明显高于对照组(321.52±57.62);PAF+GB组的CD11b的MFI(397.34±91.67)亦高于对照组;PAF组CD11b的MFI高于PAF+GB组(P<0.01,n=30)(附表、图2)。

ADP组CD11b的MFI(431.61±131.28)明显高于对照组(321.52±57.62);ADP+GB组的CD11b的MFI(293.54±55.79)与对照组无明显差异(P>0.05,n=30));ADP组CD11b的MFI高于ADP+GB组(P<0.01,n=30)(附表、图2)。

PAF组CD11b的MFI(522.65±102.18)明显高于对照组;ADP组的CD11b的MFI(431.61±131.28)亦高于对照组;PAF组CD11b的MFI明显高于ADP组(P<0.01,n=30)(附表、图2)。PLA/L的百分率及CD42b2FITC的MFIPAF组PLA/L的百分率(35.99±7.55)及CD42b2FITC的MFI(332.14±83.29)明显高于对照组(23.15±7.63,142.69±24.55);PAF+GB组的PLA/L的表达率(30.36±7.80)及CD42b2FITC的MFI(208.73±52.88)亦高于对照组;PAF组PLA/L的百分率及CD42b2FITC的MFI高于PAF+GB组(P<0.01,n=30)(附表、图3、4)。

结　　果

CD62P的表达

PAF组CD62P表达率[(76.08±7.36)%]明显高于对照组[(24.92±4.49)%];PAF+GB组CD62P的表达率[(57.83±7.04)%]亦高于对照组;PAF组CD62P表达率明显高于PAF+GB组(P<0.01,n=30)(附表、图1)。

ADP组CD62P表达率[(64.74±9.92)%]明

Table.Plateletactivation,neutrophilactivationandplatelet2leucocyteaggregatesafteraddingornoaddingagonistsandan2tagonists

Group

CD62P(%)(X󰁦±SD)

ControlPAFPAF+GBADPADP+GB

24.92±4.4976.08±7.3657.83±7.4064.74±9.9252.67±8.93

CD11bMFI(X󰁦±SD)321.52±57.62522.65±102.18397.34±91.67431.61±131.28293.54±55.79

PLA/L(%)(X󰁦±SD)23.15±7.6335.99±7.5530.36±7.8029.30±9.5227.67±9.25

CD42bMFI(X󰁦±SD)142.69±24.55332.14±83.29208.73±52.88229.96±71.04217.02±68.77

ExpressionofCD62Ponplatelets(mean±SEM,n=30).ExpressionofCD11bonneutrophils(mean±SEM,n=30).Platelet2leukocyteaggragatesinthetotalleukocytepopulation(PLA/L)andCD42bpositiveplatelet2leucocyteaggregates(CD42bmeanfluorescenceintensity:mean±SEM,n=30)

・450・Figure1.ExpressionofCD62Ponplatelet.ExpresionofCD62PonplateletinPAFgroupwassignificantlyhigherthanthatincontrolandPAF+GBgroups(P<0101).Ex2pressionofCD62PonplateletinADPgroupwasalsohigherthanthatincontrolandADP+GBgroups(P<0.01).Ex2pressionofCD62PonplateletinPAFgroupwashigherthanthatinADPgroups(P<0101).Resultswereex2pressedasmean±SEM.DatawereanalysedbyPEMS.Version2.0Statisticalsoftware

Figure2.MFIofCD11b.MFIofCD11bonnetrophilsinPAFgroupwassignificantlyhigherthanthatincontrol,PAF+GBandADPgroups(P<0.01).MFIofCD11binADPgroupwasalsohigherthanthatincontrolandADP+GBgroups(P<0.01).TherewasnosignificantdifferencebetweencontrolandADP+GBgroups.(P>0.05).Resultswereexpressedasmean±SEM.DatawereanalysedbyPEMS.Version2.0Statisticalsoftware

Figure3.PercentageofPLA/L.PLA/LinPAFgroupwassignificantlyhigherthanthatincontrol,PAF+GBandADPgroups(P<0.01).PLA/LinADPgroupwasalsohigherthanthatincontrolgroup(P<0.01).TherewasnosignificantdifferencebetweenADPandADP+GBgroups(P>0.05).Resultswereexpressedasmean±SEM.DatawereanalysedbyPEMS.Version2.0Statisticalsoft2ware

中国实验血液学杂志　JExpHematol2005;13(3)

Figure4.MFIofCD42b.Theanalysisofplatelet2leucocyteaggregates:CD42bpositiveplatlet2leucocyteaggregate(CD42bmeanfluorescenceintensity)inPAFgroupwassignificantlyhigherthanthatincontrol,PAF+GBandADPgroups(P<0101).MFIofCD42binADPgroupwasalsohigherthanthatincontrolgroups(P<0.01).MFIofCD62binPAFgroupwashigherthanthatinADPgroup.ButtherewasnosignificantdifferencebetweenADPandADP+GBgroups(P>0.05).Resultswereexpressedasmean±SEM.DatawereanalyzedbyPEMS.Version2.0Statisticalsoftware

　　ADP组PLA/L的百分率(29.30±9.52)及

CD42b2FITC的MFI(229.96±71.04)明显高于对照组;ADP+GB组的PLA/L的百分率(27.67±9.25)及CD42b2FITC的MFI(217.02±68.77)亦高于对照组(P<0.01,n=30);ADP组PLA/L的百分率及CD42b2FITC的MFI与ADP+GB组无明显差异(P>0.05n=30)(附表、图3、4)。

PAF组PLA/L的百分率及CD42b2FITC的MFI明显高于对照组;ADP组的PLA/L的百分率及CD42b2FITC的MFI亦高于对照组;PAF组PLA/L的百分率及CD42b2FITC的MFIs明显高于ADP组(P<0.01n=30)(附表、图3、4)。

讨　　论

近年来,人们注意到白细胞尤其是中性粒细胞及血小板共同参与了炎症与血栓形成的过程,在炎症部位,除白细胞外还有血小板聚集,而在血栓部位,如动脉粥样硬化、血管炎、急性心血管疾病中,除血小

板外,还有大量的白细胞黏附[10,11]

,而且,在体外的悬浮物中,发现活化的血小板黏附于中性粒细胞[12];在非生理表面,固定的血小板可以诱导中性

粒细胞滚动和黏附[13]

。

本实验用全血流式细胞术方法,以最小程度降低样本处理过程中的误差,最大限度地反映体内的生理过程,研究体内PLA形成及不同刺激剂和阻断剂对PLA的影响,了解血小板2中性粒细胞的相互作用。

血小板活化因子参与血小板2中性粒细胞活化的研究本研究发现PAF及ADP均增加CD62P、CD11b

的表达及PLA的形成,PLA形成更依赖于血小板的活化。在PLA形成中,其主要黏附分子P2选择蛋白(CD62P)在活化的血小板表面上表达,它的配体

PSGL21和CD15在白细胞上表达[14]

,血小板活化始动的PLA依赖于P2选择蛋白,白细胞活化始动的PLA依赖于PSGL2I/CD15和GPⅡb/Ⅲa2纤维蛋白原2CD11b/CD18。这表明PAF及ADP通过不同的配体2受体途径活化血小板及中性粒细胞,介导PLA形成。

GB明显抑制PAF诱导的CD62P、CD11b的表达及PLA形成,表明拮抗了外源性及细胞间的PAF,GB不能完全抑制PAF诱导的CD62P、CD11b的表达及PLA形成,表明血小板2白细胞之间的相互作用,有许多细胞因子和化学介质参与,这些细胞因子和化学介质诱导的PLA,不能被PAF受体拮抗

剂所抑制[15]

。ADP诱导的PLA可能通过其他途径实现,而不能被PAF受体拮抗剂所抑制。这说明血小板2白细胞之间的相互作用有多种细胞因子和化学介质参与其中,表明不同配体2受体系统介导PLA形成。

因此,PAF参与血小板2中性粒细胞的相互作用,机制复杂,是多种细胞因子、化学介质参与其中的病理生理过程。通过不同的刺激剂、拮抗剂的研究证实,不同配体2受体系统介导血小板2中性粒细胞的相互作用;同时也表明银杏内酯B作为银杏叶的主要药效成分有明显拮抗PAF的作用,其作为PAF受体拮抗剂在抗血栓形成、炎症中具有广泛的应用前景。

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